Иммунотоксические свойства 5%-ной суспензии Кокцидона

Фармакология, токсикология
УДК 619:615.015.4
Скачать статью в PDF формате
English version

ИММУНОТОКСИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА 5%-ной СУСПЕНЗИИ
КОКЦИДОНА

Д.С. ПОСЕЛОВ
аспирант
М.В. АРИСОВ
Научный руководитель – доктор ветеринарных наук
Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии
им. К.И. Скрябина, 117218, г. Москва, ул. Б. Черемушкинская, д.28,
e-mail: arisov@vniigis.ru

Изучены иммунотоксические свойства 5%-ной суспензии кокцидона в двух тестах. По результатам реакции гиперчувствительности замедленного типа индекс реакции у животных, получавших препарат в терапевтической дозе 0,4 мл/кг, составил 11,46, у животных, получавших 10-кратную дозу, – 11,31, а у животных контрольной группы - 14,26, что позволяет сделать вывод об отсутствии угнетающего действия 5%-ной суспензии кокцидона на Т-клеточное звено иммунной системы. Накожное однократное применение препарата в терапевтической и десятикратно увеличенной дозах не вызывает изменения интенсивности антителопродукции против тимусзависимого антигена. Индекс действия препарата в обеих дозах составил 0,98. Реакция гемагглютинации не выявила отрицательного влияния препарата на гуморальный иммунный ответ.

Ключевые слова: иммунотоксичность, кокцидон, иммунитет, гиперчувст-вительность, гемагглютинация, мыши, реакция.

Иммунотоксические свойства препарата «Кокцидон суспензия 5 %» оценивали на основе способности организма экспериментальных животных к индукции реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и выработки антител в ответ на введение тимусзависимого антигена.

Клеточный иммунитет у экспериментальных животных при введении испытуемого препарата оценивали при воспроизведении реакции гиперчувствительности замедленного типа по методу Kitamura (1980). Воспроизведение реакции ГЗТ дает представление о способности лекарственных препаратов влиять на продукцию сенсибилизированными лимфоцитами медиаторов разнонаправленного действия, вовлекающих клетки системы мононуклерных фагоцитов в иммунный ответ. Эффекты ГЗТ образуются при контакте сенсибилизированных лимфоцитов с соответствующим антигеном в присутствии макрофагов. Продукцию медиаторов клеточного иммунного ответа эффекторными клетками ГЗТ стимулировали эритроцитами барана.

При оценке действия лекарственного препарата на иммунную систему информативным показателем является интенсивность продукции антител против тимусзависимого антигена, которая дает представление о функциональной активности трех клеточных систем – Т- и В-лимфоцитов, макрофагов и их совместном воздействии.

Цель нашей работы – изучить иммунотоксические свойства 5%-ной суспензии кокцидона.

Материалы и методы

Титр антител определяли в реакции гемагглютинации (РГА), основанной на специфическом склеивании антиген-несущих частиц эритроцитов барана (ЭБ) специфическими антителами, которые выработаны при сенсибилизации и содержащимися в сыворотке крови [1-5]. Кровь для получения ЭБ брали путём венопункции в стеклянную банку. Отбивали фибрин путем помешивания до образования пены в течение 15 мин, фильтровали через капроновый фильтр и затем добавляли консервант Олсфера, состоящий из глюкозы – 2,05 г, цитрата натрия – 0,8 г, хлорида натрия – 0,42 г и дистиллированной воды – 100 мл в соотношении 1 : 1. Полученную кровь хранили в холодильнике.

Отмывание ЭБ проводили следующим образом. В две центрифужные пробирки добавляли по 3 мл крови и до 10 мл физиологического раствора (0,83 %), затем уравновешивали на весах. Центрифугировали при 1500 об. в течение 10-15 мин. Далее верхнюю часть супернатанта отсасывали пастеровской пипеткой и вновь добавляли физиологический раствор, взбалтывали и помещали в центрифугу. Процедуру повторяли 3-4 раза до образования прозрачного супернатанта, который также отсасывали.

Для получения 3%-ного раствора ЭБ в мерный стакан вместимостью 100 мл добавляли 40 мл 0,83%-ного физиологического раствора, затем добавляли 3 мл отмытых ЭБ и доводили общий объём до 100 мл.

Для постановки реакции ГЗТ и РГА было сформировано по три группы мышей-самцов линии CBA × C57 BL/6 по 10 голов массой тела 18 г. Животным первой группы вводили препарат в дозе 0,4 мл/кг перорально, однократно (терапевтическая доза). Животным второй группы вводили дозу 4 мл/кг перорально, однократно (десятикратная терапевтическая доза). Животные третьей группы препарат не получали и служили контролем.

В реакции ГЗТ всех животных подопытных групп иммунинизировали интраперитониально оптимальной дозой тест-антигена – тимусзависимый антиген – нативные ЭБ. Антиген вводили в объеме 0,5 мл 3%-ной суспензии ЭБ в стерильном физиологическом растворе. Для выявления сенсибилизации мышей на 5-е сутки в подушечку правой задней лапы вводили разрешающую дозу антигена в объеме 50 мкл 15%-ной суспензии ЭБ в физиологическом растворе (опыт) В контрлатеральную лапу вводили физиологический раствор в том же объеме. О степени выраженности воспалительной реакции на месте инъекции антигена судили по приросту массы лап через 24 ч.

О клеточной реакции формирования ГЗТ судили по величине сдвига индекса реакции (ИР), выраженного в процентах. Индекс реакции вычисляли для каждой мыши по формуле:

ИР = Мо – Мк / Мк ×100,

где Мо – масса опытной лапы; Мк – масса контрольной лапы.

Контролем служили неиммунизированные мыши, получившие только разрешающую дозу антигена.

В РГА интенсивность продукции антител против тест-антигена после введения испытуемого препарата изучали в опытах на мышах, иммунизированных интраперитонеально оптимальной дозой антигена. В качестве антигена использовали нативные ЭБ. Антиген вводили однократно внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл 3%-ной суспензии ЭБ на стерильном физиологическом растворе. Испытуемый препарат вводили после иммунизации, т. е. в индуктивную фазу иммунного ответа. Титр антител определяли на пике первичного иммунного ответа (7-е сутки после иммунизации) в микроварианте прямой РГА (Sever, 1962). Титр антител выражали в виде log ½ числа. Для сравнения выраженности иммунного ответа в опыте и контроле определяли индекс действия препарата (ИД), который представляет собой отношение титра антител в опыте к величине титра антител в контроле. Статистическую обработку проводили с помощью программы «STUDENT 200». Достоверность различий определяли по критерию Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Результаты тестирования способности организма экспериментальных животных к индукции реакции ГЗТ приведены в таблицах 1-3.

1. Реакция ГЗТ (терапевтическая доза 0,4 мл/кг перорально, однократно)

№ животного	Реакция ГЗТ
№ животного	масса правой лапы, мг (опыт)	масса левой лапы, мг (контроль)	ИР, %
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10	143,0 145,0 149,0 150,0 132,0 148,0 159,0 143,0 140,0 162,0	131,0 131,0 131,0 128,0 127,0 137,0 141,0 129,0 128,0 136,0	9,16 10,68 13,74 17,18 3,93* 8,03 12,74 10,85 9,37 19,11*
			В среднем 11,46

Примечание. * - показатель выведен из вариационного ряда при статистической обработке.

2. Реакция ГЗТ (десятикратная терапевтическая доза 4 мл/кг перорально, однократно)

№ животного	Реакция ГЗТ
№ животного	масса правой лапы, мг (опыт)	масса левой лапы, мг (контроль)	ИР, %
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10	169,0 147,0 141,0 152,0 162,0 155,0 153,0 148,0 146,0 153,0	140,0 137,0 124,0 138,0 142,0 125,0 138,0 132,0 132,0 137,0	20,71* 7,29 13,71 10,14 14,08 24,0* 10,86 12,12 10,60 11,68
			В среднем 11,31

3. Реакция ГЗТ у контрольных животных

№ животного	Реакция ГЗТ
№ животного	масса правой лапы, мг (опыт)	масса левой лапы, мг (контроль)	ИР, %
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10	149,0 154,0 158,0 144,0 165,0 160,0 152,0 164,0 160,0 155,0	132,0 135,0 147,0 125,0 144,0 132,0 130,0 145,0 137,0 132,0	12,87 14,07 7,48 15,2 14,58 21,21* 16,92 13,10 16,78 17,42
			В среднем 14,26

Пероральное однократное введение испытуемого препарата в терапевтической и десятикратно увеличенной терапевтической дозе не вызывало статистически достоверного сдвига ИР ГЗТ. Значения ИР не отличались от показателя контроля. Полученный результат указывает на индифферентность клеточного иммунитета к действию испытуемого препарата.

Результаты тестирования способности организма экспериментальных животных к антителопродукции против тимусзависимого антигена при введении испытуемого препарата приведены в таблицах 4-6.

4. РГА у белых мышей при введении кокцидона в терапевтической дозе 0,4 мл/кг перорально, однократно

№ животного	Результаты РГА
№ животного	титр антител	log ½ титра антител
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10	1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/32 1/64 1/32 1/32 1/32	5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 5,00 6,00 5,00 5,00 5,00
		В среднем 5,11

5. РГА у белых мышей при введении кокцидона в десятикратной терапевтической дозе 4 мл/кг перорально, однократно

№ животного	Результаты РГА
№ животного	титр антител	log ½ титра антител
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10	1/32 1/64 1/32 1/64 1/16 1/64 1/16 1/32 1/32 1/32	5,00 6,00 5,00 6,00 4,00 6,00 4,00 5,00 5,00 5,00
		В среднем 5,10

6. РГА у белых мышей при введении кокцидона в десятикратной терапевтической дозе 4 мл/кг перорально, однократно

№ животного	Результаты РГА
№ животного	титр антител	log ½ титра антител
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10	1/32 1/64 1/32 1/32 1/32 1/32 1/64 1/32 1/32 1/32	5,00 6,00 5,00 5,00 5,00 5,00 6,00 5,00 5,00 5,00
		В среднем 5,20

Полученные результаты свидетельствуют о том, что пероральное однократное применение испытуемого препарата в терапевтической и десятикратно увеличенной дозе не вызывает изменений интенсивности антителопродукции против тимусзависимого антигена. Титр гемагглютининов в сыворотке крови животных, получивших различные дозы кокцидона, не отличался от такового в контроле. На толерантность гуморального иммунного ответа к действию кокцидона в испытанных дозах указывают также индексы действия препарата, равные 0,98 (табл. 7).

7. Интенсивность антителопродукции против тимусзависимого антигена у мышей при пероральном введении 5%-ной суспензии кокцидона

Группа животных

Доза препарата, мл/кг

Кратность введения

log ½ титра антител

ИД

I
II

Контроль

0,4

Однократно

5,11±0,30

5,10±0,52

5,20±0,30

0,98

Таким образом, по данным реакции ГЗТ пероральное однократное введение 5%-ной суспензии кокцидона в терапевтической и десятикратно увеличенной дозах не оказывает негативного действия на клеточный иммунитет. По данным РГА пероральное однократное введение препарата в терапевтической и десятикратно увеличенной дозах не оказывает негативного действия на гуморальный иммунный ответ. Препарат в испытанных дозах не обладает иммунотоксическими свойствами.

Литература

1. Daugalieva E.H. и dr. Metodicheskie rekomendacii po izucheniju vlijanija antgel’mintikov na immunnii status zhivotnih pri gel’mintozah. – М., 1989. – 12 s.

2. Petrov R.V. Immunologija. – М.: Medicina, 1987. – 387 s.

3. Haitov R.М. и dr. Metodicheskie ukazanija po izucheniju immunotropnoi aktivnosti farmakologicheskih veschestv. – М., 1998. – 10 s.

4. Kitamura K. A footpad weight assay method to evaluate delayed-type hypersensitivity in the mouse // Immunol. Methods. – 1980. – V. 39, № 3. – P. 277-283.

5. Sever J.L. Application of a micro-technique to viral serological investigations // J. Immunol. – 1962. – V. 88, № 1. – P. 398-413.