Скачать статью в PDF формате
English version
Биохимия, биотехнологии и диагностика
УДК 619:616.995.122.21
ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ МЕТАЦЕРКАРИЙ
Opisthorchis felineus и Rhipidocotyle campanula
О.Т. РУСИНЕК1
доктор биологических наук Ю.Л. КОНДРАТИСТОВ2
соискатель Р.В. РУДОВ2
аспирант
1 Байкальский музей СО РАН,
664520, Иркутск, п. Листвянка, ул. Академическая, д. 1, e-mail: bm@irk.ru
2 Иркутская межобластная ветеринарная лаборатория
Приведены результаты изучения совместной ин- вазии карповых рыб метацеркариями Opisthorchis fe- lineus и Rhipidocotyle campanula. Метод переваривания в искусственном желудочном соке можно рекомендо- вать для использования при дифференциальной диа- гностике метацеркарий O. felineus и R. campanula.
Ключевые слова: метацеркария, Opisthorchis felineus, Rhip- idocotyle campanula, дифференциальная диагностика.
Метацеркарии Opisthorchis felineus и Rhipidocotyle campanula по морфо- логическим признакам имеют определенное сходство. Размер цисты мета- церкарии O. felineus – 0,17 х 0,21–0,25 х 0,33 мм, R. campanula – 0,27–0,51 х 0,27–0,37 мм [10].
Характерные отличительные морфологические признаки этих трематод (форма цисты, ротовой присоски и выделительного пузыря) можно использо- вать только при микроскопическом исследовании метацеркарий. Метацерка- рии O. felineus отличаются округлой формой цисты и ротовой присоски; вы- делительный пузырь в проходящем свете имеет вид большого темного округ- лого пятна. Для метацеркарий R. campanula характерна циста эллипсовидной формы; ротовая присоска снабжена мышечными сосочками, выдающимися по бокам головного конца в виде «ушек» или «веера»; выделительный пузырь сравнительно длинный, темный, S-образной формы. Как известно, некоторые морфологические особенности метацеркарий (например, строение ротовой присоски) можно рассмотреть только после выделения личинки из цисты.
Существующее морфологическое сходство этих двух видов может вызы- вать определенные трудности при диагностике по методу компрессионной микроскопии в том случае, если оба вида заражают одного хозяина, встреча- ются в одном водоеме или в одном рыбопромысловом районе. Поэтому воз- никает необходимость в дифференциальной диагностике метацеркарий O. felineus от метацеркарий R. campanula. У исследователей, не имеющих доста- точного практического опыта, дифференциация личинок описторхисов от личинок рипидокотиле вызывает затруднения и в некоторых случаях может влиять на точность результатов. В этом случае недостоверность данных пара- зитологического исследования карповых рыб отряда Cypriniformes, чаще всего, может быть выражена ошибочным определением метацеркарий рипи- докотиле как личинок описторхиса. Следствием такой диагностической ошибки может быть постановка диагноза описторхоза рыб, а не рипидокотилеза, либо также возможно завышение показателей зараженности рыб мета- церкариями O. felineus.
Цель исследования – изучение очага описторхоза в Иркутской области. Необходимо было изучить зараженность карповых рыб O. felineus и R.campanula из реки Бирюсы и провести анализ физиолого-биохимических особенностей выживания метацеркарий O. felineus и гибели метацеркарий R. campanula в искусственном желудочном соке.
Материалы и методы
Река Бирюса, протекающая по территории Тайшетского района, Иркут- ской области неблагополучна по описторхозу рыб [5–7]. Согласно требова- ний нормативной документации (МУ 3.2.1756-03) «Эпидемиологический надзор за паразитарными болезнями», мониторинг гельминтозоонозов рыб, и в частности, описторхоза, должен проводиться не реже одного раза в три года: карповую рыбу, обитающую в неблагополучном естественном рыбопромысло- вом водоеме, необходимо исследовать на зараженность личинками O. felineus [9].
При исследовании мышечной ткани рыб по методу компрессионной микро- скопии за 2000–2008 гг. были получены результаты, сведенные в таблицу 1.
1. Результаты многолетних исследований зараженности мышечной ткани рыб методом компрессионной микроскопии (р. Бирюса, Тайшетский район, Иркутская область)
|
Год ис- след. |
Место выло- ва рыбы |
Вид рыбы, экз. |
O. felineus |
R. campanula |
||
|
ЭИ, % |
ИИ, экз. |
ЭИ, % |
ИИ, экз. |
|||
|
2000 |
п. Бирюсинск |
Елец, 80 |
2,5 |
Единич. |
92,0 |
4–24 |
|
2003 |
п. Бирюсинск |
Елец, 50 |
0 |
0 |
90,0 |
3–16 |
|
2007 |
с. Н.Заимка |
Елец, 35 |
8,6 |
1–8 |
31,4 |
2–7 |
|
д.Тракт Ужет |
Елец, 32 |
3,1 |
Единич. |
25,0 |
2–8 |
|
|
Устье р.Топорок |
Елец, 49 |
6,1 |
1–3 |
45,0 |
2–34 |
|
|
2008 |
Борисовская старица |
Елец, 29 |
10,3 |
2–3 |
31,0 |
2–5 |
|
Плотва, 21 |
0 |
0 |
14,2 |
2–3 |
||
|
с. Конторка |
Елец, 6 |
16,6 |
5 |
33,3 |
4–6 |
|
|
Плотва, 242 |
0,4 |
5 |
32,2 |
1–21 |
||
|
п. Ново- тремино |
Елец, 55 |
5,4 |
1–2 |
60,0 |
36–105 |
|
|
д. Троицк |
Плотва, 20 |
0 |
0 |
5,0 |
3 |
|
В мышцах карповых рыб, обитающих в р. Бирюса, кроме метацеркарий
O. felineus, отмечены и метацеркарии R. campanula, которых по сравнению с личинками описторхисов регистрировали с более высокой экстенсивностью и интенсивностью инвазии.
В 2008 г. кроме метода компрессионной микроскопии, использовали ме- тод переваривания мышечной ткани рыб в искусственном желудочном соке [3, 4]. Этот метод позволяет извлечь до 98 % метацеркарий [1]. Биохимиче- ские исследования проводили согласно методическим указаниям МУК 3.2.988–00 «Методы санитарно-паразитологической экспертизы рыбы, мол- люсков, ракообразных, земноводных, пресмыкающихся и продуктов их пере- работки» (2001) [8].
Результаты и обсуждение
При микроскопии осадка, полученного по методу переваривания мы- шечной ткани рыб в искусственном желудочном соке, обнаруживали или только метацеркарий O. felineus, или личинки гельминтов отсутствовали. Ме- тацеркарии R. campanula не были отмечены после выдерживания мышц в же- лудочном соке. Подобные результаты неизменно повторялись при неодно- кратных биохимических исследованиях мышечной ткани рыб.
Наличие в осадке, полученном при исследовании рыбы на описторхоз по методу переваривания мышц в искусственном желудочном соке, метацерка- рий O. felineus, было подтверждено биологической пробой, проведенной по методике МУК 3.2.988-00 [8]. В качестве подопытных животных использова- ли золотистых хомяков, которым вводили через рот личинки описторхисов, полученные в результате переваривания мышц рыб в искусственном желу- дочном соке. Через 21 сут после заражения при копрологическом исследова- нии фекалий подопытных животных были обнаружены яйца O. felineus. При вскрытии золотистых хомяков в желчных протоках печени были обнаружены половозрелые O. felineus.
Полученные результаты вызвали сомнения по поводу отсутствия в осад- ке, полученном при исследовании рыбы на зараженность трематодами по ме- тоду переваривания мышц в искусственном желудочном соке, личинок рипи- докотиле. При этом, согласно результатам паразитологических исследований мышц по методу компрессионной микроскопии, карповые рыбы в р. Бирюсе значительно инвазированы метацеркариями R. campanula (табл. 2).
2. Показатели экстенсивности и интенсивности заражения карповых рыб метацеркариями O. felineus и R. campanula
(сводные данные за 2000, 2003, 2007, 2008 гг.)
|
|||||||||||||||
Для объяснения этой ситуации обратились к данным по физиологии пи- щеварения второго промежуточного и окончательного хозяев O. felineus и R. campanula. Для нас было важно сопоставить искусственные условия in vitro при исследовании по методу переваривания мышечных тканей рыб в искус- ственном желудочном соке (в указанные условия помещали фарш из мышеч- ной ткани исследуемой карповой рыбы), с естественными условиями среды в желудках дефинитивных хозяев, в жизненном цикле трематод O. felineus и R. сampanula (табл. 3).
3. Условия среды в желудках человека, плотоядных животных, хищных рыб и искусственно созданные условия при исследовании рыбы на описторхоз по
методу переваривания в искусственном желудочном соке
|
Фактор среды |
Показатель среды в желудке |
Показатель среды в искусственном же- лудочном соке |
||
|
человека |
плотоядных животных |
хищной рыбы |
||
|
рH |
1,5–1,8 |
1,5–2,5 |
3,3–4,0 |
1,5 |
|
HCl % |
0,3–0,5 |
0,4–0,5 |
1,5–3 |
0,4 |
|
Фермент |
Пепсин |
Пепсин |
Пепсин |
Пепсин |
|
Температура |
36,6 |
38,0–40,0 |
Темпера- тура окружаю- щей среды |
36–37 |
Для трематоды O. felineus основными дефинитивными хозяевами явля- ются человек и плотоядные животные, для R. campanula – пресноводные хищные рыбы (щука, окунь, ерш, судак).
Известно, что соляная кислота способствует набуханию пищи, растворя- ет кости, кальцинированные кожные образования – чешую, жучки, панцирь моллюсков и хитиноидные образования других беспозвоночных, а также участ- вует в регуляции процесса эвакуации желудочного содержимого в кишечник.
В результате сравнительного анализа условий среды в желудках дефини- тивных хозяев O. felineus и R. campanula, а также искусственно созданных условий in vitro, при исследовании рыбы по методу переваривания мышц, были получены следующие данные:
- естественные показатели среды в желудках дефинитивных хозяев тре- матоды O. felineus и показатели искусственного желудочного сока в условиях in vitro очень близки между собой;
- естественные показатели среды в желудках дефинитивных хозяев тре- матоды R. campanula и искусственного желудочного сока в условиях in vitro, существенно отличаются по значениям рН: в среднем, выше на 1,8 и темпе- ратуры, в среднем, ниже на 12 °С (если учесть что наиболее высокая темпе- ратура воды в естественных рыбопромысловых водоемах средней полосы России и Сибири в летний период составляет 20–25 °С).
У животных основное пищеварение и всасывание пищевых веществ про- исходит в кишечнике. В желудке осуществляется частичное переваривание белков, которое завершается в кишечнике. Важно понимать, что пищеварение в желудке – это сложный процесс, который кроме адаптационных механиз- мов, регулируется составом пищи и пищеварительными соками. Выработка HCl также определяется качеством пищи [11].
В желудочных железах костистых рыб выявлен только один тип секре- торных клеток, которые выделяют пепсин и соляную кислоту [12].
Гидролиз белков при участии пепсина относится к внеклеточному ди- стантному (или полостному) типу пищеварения [12]. Гидролиз белков пепси- ном осуществляется при рН 1,5–2,5 и температуре 40–50 °С [13]. Эти условия очень близки к таковым среды в желудках дефинитивных хозяев O. felineus, а также к условиям среды, созданным in vitro, по методу переваривания мышц в искусственном желудочном соке и существенно отличаются от условий среды в желудках дефинитивных хозяев R. campanula.
Соединительно-тканная капсула метацеркарий O. felineus сравнительно тонкая. Она имеет типичное строение и состоит из наружного и внутреннего слоев [1]. Учитывая то, что ткани метацеркарий описторхиса и рипидокотиле, в основном, состоят из белка, можно предположить, что, попав в искусствен- но созданные условия среды in vitro, (при исследовании рыбы по методу пе- реваривания в искусственном желудочном соке), которые близки к условиям в желудках дефинитивных хозяев O. felineus и оптимальны для гидролиза белка пепсином, метацеркарии рипидокотиле не выдерживают воздействия таких условий искусственной среды и гидролизуются, а у метацеркарий опи- сторхиса гидролизируются только оболочки цист, сами метацеркарии оста- ются неповрежденными и сохраняют свою структуру, жизнеспособность и инвазионность.
Различную устойчивость метацеркарий O. felineus и R. campanula к усло- виям среды, близкой к оптимальным для гидролиза белка пепсином, вероятно можно объяснить приспособительными особенностями этих гельминтов.
Циклы развития O. felineus и R. campanula относятся к триксенным [2]. Только у первого паразита окончательный хозяин – плотоядные млекопита- ющие и человек, а у второго – хищные рыбы.
Биологический цикл развития O. felineus характеризуется тем, что для дальнейшего развития паразита до половозрелой стадии необходимо, чтобы второй промежуточный хозяин (карповая рыба), в мышечной ткани которого
локализуется метацеркария, попал в пищеварительный тракт дефинитивного хозяина - плотоядного животного или человека. В желудках указанных дефи- нитивных хозяев среда близка к оптимальной для гидролиза белка пепсином. К таким условиям приспособлена метацеркария описторхиса, к ним она устойчива и сохраняет свою структуру и жизнеспособность. В желудке дефи- нитивного хозяина метацеркария освобождается от цисты и через желчные протоки проникает в желчный пузырь печени, где развивается до половозре- лой стадии (при попадании в органы пищеварения хищных рыб описторхис погибает).
Биологический цикл R. campanula характеризуется тем, что для даль- нейшего развития паразита до половозрелой стадии необходимо, чтобы про- межуточный хозяин (карповая рыба), в мышечной ткани которого локализу- ется метацеркария, попал в пищеварительный тракт дефинитивного хозяина – хищной пресноводной рыбы (щука, окунь, ерш, судак). В желудке хищных рыб среда отличается значительной реакционностью и сравнительно низкой температурой. Метацеркария репидокотиле в желудке окончательного хозяи- на под воздействием пепсина и соляной кислоты теряет оболочку цисты, ми- грирует в кишечник и заканчивает там свое развитие (при попадании в орга- ны пищеварения плотоядных животных и человека репидокотиле погибает в несвойственной для него среде обитания).
На основании вышеизложенного можно сделать следующие заключения:
- метацеркарии R. campanula не выдерживают условий, созданных in vitro, при исследовании карповой рыбы на O. felineus по методу переварива- ния в искусственном желудочном соке; в этих условиях они полностью гид- ролизируются;
- метацеркарии O. felineus сохраняются в условиях in vitro при исследо- вании карповой рыбы на описторхоз по методу переваривания мышц в искус- ственном желудочном соке. В этой среде метацеркарии описторхиса осво- бождаются от цист, сохраняют свою структуру и жизнеспособность в физрас- творе в течение 10–24 ч при комнатной температуре и могут служить матери- алом для заражения лабораторных животных с целью постановки биологиче- ской пробы;
- метод переваривания в искусственном желудочном соке можно реко- мендовать для использования при дифференциальной диагностике мета- церкарий O. felineus и R. campanula (возможно и метацеркарий других трема- тод, паразитирующих в мышечной ткани карповых рыб, в биологических циклах развития которых дефинитивными хозяевами являются хищные ры- бы, а не млекопитающие животные и человек).
Работа выполнена при поддержке программы СО РАН «Геномика, протеомика, биоинформатика», госконтракта Роснауки № 02.512.11.2332 и гранта РФФИ 09-04- 12209-офи_м.
Авторы выражают свою благодарность сотрудникам ветеринарной службы ОГУ Тайшетская СББЖ Д.В. Демину и И.В. Пустынскому и Тайшетскому межрайонному отделу контроля, надзора и рыбоохраны Ангаро-Байкальского территориального управления Федерального агентства по рыболовству за оказание практической по- мощи в сборе материала для исследований и главному государственному инспектору В.И. Бахарь и госинспектору Н.Н. Сапелкиной.
Литература
1. Беэр С.А. Биология возбудителя описторхоза. – М: Товарищество научных изданий КМК, 2005. – 336 с.
2. Галактионов К.В., Добровольский А.А. Происхождение и эволюция жизненных циклов трематод. – Санкт-Петербург: Наука, 1998. – 404 с.
3. Глазков Г.А. К методике выделения метацеркариев сибирской двууст- ки из мышечной ткани пораженной рыбы // Проблема описторхоза в Запад- ной Сибири. – Л., 1977. – С. 53–54.
4. Глазков Г.А. Выделение метацеркариев некоторых трематод из пора- женной ткани рыб методом переваривания в искусственном желудочном соке
// Болезни и паразиты рыб Ледовитоморской провинции (в пределах СССР). – Томск, 1979. – С. 72–82.
5. Клебановский В.А., Журина Т.А., Житницкая Э.А. и др. Новые данные об ареале описторхоза в Центральной Сибири // Мед. паразитол. и паразит. бол. – 1984. – № 3. – С. 7–11.
6. Колокольцев М.М., Казакова А.А., Житницкая Э.А. Описторхоз в Тай- шетском районе Иркутской области // Гигиена и здоровье человека. – Ир- кутск, 1982. – С. 48–49.
7. Колокольцев М.М., Афраков В.Ф., Колокольцева И.А. Описторхоз у до- машних кошек Тайшетского района Иркутской области // Мед. паразитол. и паразит. бол. – 1984. – № 3. – С. 82.
8. Методы санитарно-паразитологической экспертизы рыбы, моллюсков, ракообразных, земноводных, пресмыкающихся и продуктов их переработки (МУК 3.2.988–00). – М.: Минздрав России, 2001. – 69 с.
9. Методические указания. МУ 3.2.1756-03 «Эпидемиологический надзор за паразитарными болезнями. – М., 2005. – 83 с.
10. Определитель паразитов пресноводных рыб фауны СССР. Паразити- ческие многоклеточные. – Л.: Наука, 1987. – Т. 2, Ч. 2. – 583 с.
11. Сорвачев К.Ф. Основы биохимии питания рыб. – М.: Легкая и пище- вая промышленность, 1982. – 247 с.
12. Уголев А.М., Кузьмина В.В. Пищеварительные процессы и адаптации у рыб. – Санкт-Петербург: Гидрометеоиздат, 1993. – 238 с.
13. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. – М.: Высшая школа, 1969. – 595 с.
© 2015 The Author(s). Published by All-Russian Scientific Research Institute of Fundamental and Applied Parasitology of Animals and Plants named after K.I. Skryabin.
This is an open access article under the Agreement of 02.07.2014 (Russian Science Citation Index (RSCI)) and the Agreemnt of 12/06/2014 (CABI org / Human Sciences section)