Токсикологическая оценка инсектоакарицидного препарата инсакар при арахноэнтомозах плотоядных животных.

Ключевые слова: инсакар, токсичность, кумуляция, крысы, мыши, гематологические и биохимические показатели.

Для расширения ассортимента отечественных противопаразитарных средств на базе ВНИИ гельминтологии им. К.И. Скрябина разработан новый препарат с инсектоакарицидным действием инсакар, содержащий в качестве ДВ фипронил, пирипроксифен и бензилбензоат.

Препарат представляет собой прозрачную маслянистую жидкость свет- ло-желтого цвета, со слабым специфическим запахом. Препарат применяют путем топикального (точечного) нанесения на кожу.

Одной из основных задач, возникающих при изучении токсического дей- ствия препарата, является выявление побочных нежелательных эффектов и исключение отдаленного действия на организм животных [1, 3, 6].

Целью нашей работы было определение параметров острой токсичности препарата инсакар при пероральном введении и накожном нанесении, изуче- ние кумулятивных свойств, оценка местного и кожно-резорбтивного дей- ствия препарата.

Материалы и методы

Изучение токсикологических свойств препарата инсакар проводили в виварии ВИГИС на белых крысах-самцах, белых мышах и кроликах массой тела соответственно 210–230 г, 18–23 г и 2,0–2,3 кг. В опытах использовали брали клинически здоровых животных, которые предварительно находились на 15-дневном карантине. Группы состояли из 4–10 животных.

Расчет параметров острой токсичности инсакара проводили в соответ- ствии с Методическими рекомендациями по изучению общетоксического действия фармакологических веществ (1997), используя метод Кербера в мо- дификации Прозоровского [1, 6].

В опытах при введении препарата в желудок использовали 36 белых мышей. Готовили 30%-ный раствор и вводили с помощью иглы с булавовид- ным утолщением в желудок натощак. Препарат вводили в диапазоне доз 0,2 мл/гол (3000 мг/кг) – 0,45 мл (6750 мг/кг). Для каждой дозы использовали по 6 мышей.

За мышами вели наблюдения в течение 2-х недель. Учитывали характер токсического действия: поведение, двигательную активность, состояние шерстного покрова, нарушение физиологических функций.

В связи с тем, что препарат рекомендуют применять накожно изучали его острую токсичность при накожном применении.

В опыте использовали белых беспородных крыс массой по 300 г. За сут- ки до нанесения препарата выстригали участок кожи размером 6 х 6 см в об- ласти спины. Препарат наносили на кожу в дозах: 6 мл (20000 мг/кг), 8 мл (26666 мг/кг) и 10 мл (33333 мг/кг). На каждую дозу использовали по 4 кры- сы. Дозы 8 и 10 мл наносили дважды с интервалом 10 мин. После обработки крыс помещали в индивидуальные камеры на 4 ч. В дальнейшем, животных содержали в обычных клетках. В течение 30 сут после начала опыта вели наблюдение за внешним видом, состоянием и поведением крыс. Отмечали характер проявления признаков токсикоза и падеж животных.

Кумулятивные свойства препарата изучали по методу Лима с соавт. [8]. Опыт проводили на 30 белых мышах массой 19–20 г. В качестве контроля служили 30 мышей. Все животные содержались на стандартном корме, оди- наковом для подопытных и контрольной групп. Препарат вводили животным ежедневно, индивидуально, при помощи металлического зонда, алиментар- ным путем в виде 30%-ного водного раствора. В течение первых четырех дней животные подопытной группы получали препарат в дозе, равной 0,1 от ранее установленной однократной ЛД50. На 5-е сутки дозу увеличивали в 1,5 раза. В течение 30 сут за всеми животными вели наблюдения, отмечая их смертность. Результаты оценивали по отношению средних эффективных доз острого и подострого экспериментов по формуле Кkum = ЛД50(подостр)/ ЛД50(остр), откуда следует: если коэффициент кумуляции меньше 1, то ис- пытуемый препарат обладает кумулятивными свойствами; если больше 1 – то отмечается повышенная устойчивость к препарату (слабо выраженная куму- ляция) [7].

Местное и кожно-резорбтивное действие инсакара изучали на крысах при нанесении препарата 5 раз с интервалом 5 сут в дозах 1 мл/гол, что в 2,5 раза превышает срок применения в практических условиях, и в 5 раз повы- шенной дозе. Кроме того, в опытах на кроликах изучали местное действие препарата на слизистые оболочки глаз.

Местное действие препарата на кожу изучали на 12 белых беспородных крысах обоего пола массой 250–310 г., разделенных на подопытную и кон- трольную группы по 6 голов. За сутки до эксперимента у каждого животного в области спины выстригали участки кожи размером 3 х 3 см и определяли толщину кожной складки. На выстриженный участок наносили пипеткой препарат в дозе 1 мл. Оценку реакции кожи проводили по системе, принятой по Range Finding Test: очень слабое покраснение – 1 балл, вполне определен- ное покраснение – 2, умеренное, до сильного покраснение – 3, тяжелая эри- тема с образованием корочек – 4 балла.

Действие препарата на конъюнктиву глаза изучали на 3 кроликах. Жи- вотным глазной пипеткой закапали в правый глаз по 2–3 капли испытуемого препарата, а в левый по 2–3 капли чистого подсолнечного масла (контроль). Наблюдение за животными вели в течение 1 ч, и затем в течение 3 сут еже- дневно. Действие препарата на слизистую глаз оценивали по характеру конъюнктивита и кератита.

Кожно-резорбтивное действие инсакара оценивали по специфическим и интегральным показателям через сутки после последней обработки. Гемато-логические исследования проводили на гематологическом анализаторе PCE 90-vet (США) (определяли динамику числа эритроцитов, лейкоцитов, уровень гемоглобина, величину гематокрита). По общепринятым методам выводили лейкограмму и определяли СОЭ. По биохимическим тестам оценивали обмен веществ в организме и работу внутренних органов: почек, печени, поджелудочной железы и др. Основные показатели определяли на биохими- ческом анализаторе «А-125 биосистем» [4–7].

Статистическую обработку цифровых показателей выполняли по Стью- денту–Фишеру на персональном компьютере Pentium-4 с использованием программ Microsoft Excel, Microsoft Access и BIOSTAT.

Результаты и обсуждение

Изучение острой токсичности при пероральном введении. В первые сутки после введения препарата гибель животных отмечали от больших доз препаратов (6000–6750 мг/кг массы тела). Малые дозы не вызывали гибели мышей. Однократное введение препарата в больших дозах вызывало общее угнетение, судорожные явления; мыши зарывались в подстилку и вскоре от- мечали их гибель. В последующие двое суток фиксировали гибель от доз 3750–5250 мг/кг. Максимальной переносимой дозой, при которой не отмеча- ли гибели животных, была 3000 мг/кг. Мыши начинали погибать при введе- нии препарата в дозе 3750 мг/кг. Абсолютная смертельная доза для белых мышей составила 6750 мг/кг (табл. 1). При вскрытии павших животных уста- новлены патологоанатомические изменения, свойственные острому отравле- нию: брыжеечные сосуды кровенаполнены, увеличена печень и селезенка, на слизистой оболочке желудка и кишечника геморрагические воспаления.

1. Параметры острого токсического действия препарата инсакар для мышей при введении в желудок

Расчет параметров токсичности:

ЛД50 = ЛД100 – Σ Zd : n = 6750 – 9750 : 6 = 5125 мг/кг.

Следует отметить, что после трех суток падежа мышей не отмечено, но общее состояние у некоторых мышей оставалось неудовлетворительным в течение 5 сут. В дальнейшем клиническое состояние нормализовалось.

Таким образом, ЛД50 инсакара при введении внутрь для мышей состави- ла 5125÷226 мг/кг, что дает основание отнести данный препарат к 4 классу токсичности – малоопасные по ГОСТ 12.1.007-76. [2].

Изучение острой кожной токсичности. Установлено, что в течение всего срока наблюдения не отмечали изменений внешнего вида и нарушений видимых физиологических функций. В группах, где наносили препарат в до- зах 8 и 10 мл наблюдали признаки интоксикации по истечении 1–3 сут (тре- мор, судороги, взъерошенность). В течение 10 сут во второй группе пала одна крыса, в третьей – три крысы. Достижение 100%-ного эффекта было невоз- можно ввиду требуемых больших доз препарата. ЛД100 определяли методом пробит-анализа [1].

В результате обработки экспериментальных данных ЛД50 препарата со- ставила 41833 мг/кг.

По гигиенической классификации (ГОСТ 12.1.007-76) в соответствии с установленными параметрами кожной токсичности для крыс препарат инса- кар относится к 4 классу опасности [2].

Изучение кумулятивных свойств. Для изучения кумулятивных свойств установили первоначальную дозу препарата, которая составила 0,1 от ранее установленной однократной ЛД50 – 512,5 мг/кг или 0,0342 мл/гол. 30%-ного водного раствора. Для удобства введения препарата внутрь мышам и после- дующих расчетов, незначительно округлили значения первоначальных доз, которые составили 525 мг/кг или 0,035 мл/гол 30%-ного водного раствора. Результаты приведены в таблице 2.

2. Изучение кумулятивных свойств препарата инсакар

В результате обработки экспериментальных данных ЛД50  препарата при многократном введении в желудок составила 13092,8  мг/кг.

Используя формулу Кагана–Станкевича, определили коэффициент куму- ляции:

ЛД50 многократно     13092,8

К= -------------------------- = ---------- = 2,55.

ЛД50 однократно        5125

Учитывая суммарную дозу (ЛД50 многократная) препарата, определили коэффициент кумуляции, который составил 2,55. По классификации веществ по кумулятивным свойствам исследуемый препарат относится к группе ве- ществ со слабо выраженной кумуляцией.

Изучение местного действия на кожу. При нанесении препарата инса- кар у одной из трех крыс регистрировали наличие изменений кожи в течение 1 ч в виде покраснения (2 балла), в течение 12 ч переходящая в слабое по- краснение (1 балл). У второго животного регистрировали слабое покраснение в течение 12 ч. Общая сумма баллов составила 2,5, что позволяет классифи- цировать местно-раздражающее действие препарата как слабое (4 класс опас- ности).

Восстановление функционального состояния кожи протекало без посто- роннего вмешательства в течение суток после прекращения нанесения препа- рата.

Изучение местного действия на слизистые оболочки глаз. Проводили через 1, 24, 48 и 72 ч по изменению кровенаполнения конъюнктивы, наличию лакримаций и состоянию роговицы глаза по 10-бальной системе. Результаты исследований приведены в таблице 3.

При нанесении препарата у кроликов отмечали выраженную гиперемию и слезотечение. Эти явления исчезли через 24 ч.

3. Оценка раздражающего действия препарата инсакар при воздействии на конъюнктиву глаза кролика

5. Показатели функциональной активности печени и состояния белкового, жирового и углеводного обмена крыс при накожном пятикратном нанесении

препарата инсакар

6. Массовые коэффициенты внутренних органов крыс после пятикратного нанесения препарата инсакар

Как следует из таблицы, пятикратное накожное применение препарата не привело к достоверному изменению массовых коэффициентов почек, легких, селезенки, сердца и печени по сравнению с контрольными животными.

Литература

1. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологическо- го эффекта. – Л.: Госмедиздат, 1963. – 151 с.

2.    Гост 12.1.007-76. Система стандартов безопасности труда: вредные вещества: классификация и общие требования безопасности. – М., 1984.

3. Жуленко В.Н., Рабинович М.И., Таланов Г.А. Ветеринарная токсиколо- гия. – М.: Колос, 2001. – 384 с.

4. Клиническая лабораторная диагностика в ветеринарии. – М., 1985. – С. 134–136.

5. Кост Е.А. Справочник по клиническим лабораторным методам иссле- дования. – М., 1975. – 253 с.

6. Методические рекомендации по изучению общетоксического действия фармакологических средств, утвержденные Минздравом РФ 29 декабря 1997 г. // Ведомости Фармакоп. Комитета. – 1998. – № 1. – С. 27–32.

7.   Методические рекомендации по изучению раздражающих свойств и обоснованию предельно допустимых концентраций веществ в воздухе рабо- чей зоны. – 1980. – 25 с.

8. Lim R.K., Rink K.G., Glass H.G. // Arch. Internat. Pharmacodyn. – 1961. – V. 130, № 3–4. – P. 336–353.