Биохимия, биотехнология и диагностика
УДК 619:616.995.132
Скачать статью в PDF формате
English version
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЛИЧИНОК Toxocara canis
ИЗ ПАРЕНХИМЫ ПЕЧЕНИ И ЛЕГКИХ ПЛОТОЯДНЫХ ЖИВОТНЫХ
О.А. ПАНОВА
аспирант
И.Г. ГЛАМАЗДИН
доктор ветеринарных наук
Московский государственный университет пищевых производств,
125080, Москва, Волоколамское ш., д. 11, e-mail:
С.К. ШИБИТОВ
Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория,
e-mail:
Предложен способ выделения личинок Toxocara canis из паренхимы печени и легких плотоядных животных для посмертной диагностики токсокароза при слабой инвазии и в период препатентной стадии. Полученную культуру личинок T. canis можно использовать для изучения патогенеза болезни, проведения генетических исследований и получения белков с диагностическими и протективными свойствами. Дан перечень оборудования, реактивов и растворов для выделения личинок T. canis. Описан ход работы, который состоит из подготовки проб ткани печени и легких, приготовления искусственного желудочного сока, переваривания проб тканей, оценки результатов, концентрации личинок T. canis. Для исследований берут пробы паренхимы легких или печени массой 50 г, измельчают на мясорубке. Пробы переваривают в течение 50 мин при температуре 41-42 оС при постоянном перемешивании. После 10-минутного отстаивания осадок сливают в чашки Петри и исследуют на наличие личинок T. canis и их подвижность. Для концентрации материала осадок центрифугируют 10 мин при 5000 об./мин.
Ключевые слова: личинки, Toxocara canis, печень, легкие, плотоядные, переваривание, диагностика.
Токсокароз – инвазионная зоонозная болезнь, имеющая важное эпидемиологическое и большое социальное значение, возбудителем которого является нематода семейства Anisakidae, рода Toxocara, вид Toxocara canis (Werner, 1782) - паразит псовых.
Пути миграции паразита зависят от возраста и вида хозяина. Наиболее интенсивно заражаются молодые собаки, а щенки от рождения до 30 сут заражены токсокарами на 90-100 %. Большинство личинок, вышедшие из яиц в пищеварительном тракте, совершают гепато-пульмональную миграцию и достигают половозрелой стадии в кишечнике. Впоследствии начинается выделение яиц токсокар во внешнюю среду. Одна самка токсокары способна выделить 200 000 яиц в сутки с фекалиями, поэтому контаминация окружающей среды повышается очень быстро. У собак старше года личинки обычно накапливаются в соматических тканях и остаются жизнеспособными в течение 2–3 лет [4]. В период беременности и повышения гормонального фона при лактации личинки могут проявить свою активность и продолжить миграцию и при этом часто попадают в органы и ткани плода. Высокий процент зараженности собак токсокарами является следствием пожизненного бессимптомного паразитирования личинок [3].
До сих пор недостаточно изучены особенности патогенеза, эпизоотологии, патоморфологии тканей при ларвальном токсокарозе, продолжительность сохранения инвазионных свойств личинок у взрослых плотоядных [2]. Мигрирующие личинки токсокар могут вызывать различные патологические реакции в тот период, когда их диагностика затруднена [1].
Данные о выделении личинок токсокар II стадии из органов щенят методом переваривания в литературе отсутствуют.
Разработанный способ выделения мигрирующих личинок токсокар можно применять для посмертной диагностики данной болезни при слабой инвазии и, когда в кишечнике еще нет половозрелых гельминтов, для изучения патогенеза данного паразитоза. С другой стороны, можно получать чистую культуру личинок, что может служить материалом для дальнейших генетических исследований, а также для получения белков с хорошими диагностическими или протективными свойствами. Результаты проведенных исследований позволяют разрабатывать и совершенствовать методы диагностики токсокароза плотоядных на стадии миграции паразитов.
Оборудование: аппарат «Gastros» для выделения личинок трихинелл (производство ПетроЛазер, г. Санкт-Петербург); лупа лабораторная (ГОСТ 25706-83 «Лупы. Типы, основные параметры. Общие технические требования»); микроскоп биологический (МБИ) (ГОСТ 28489-90 «Микроскопы световые»); мясорубка бытовая (с диаметром решетки 3-4 мм) (ГОСТ 4025 «Мясорубки бытовые. Технические условия»); весы лабораторные общего назначения CAS MWP-1500, 2-го класса точности (ГОСТ 24104-2001 «Весы лабораторные. Общие технические требования»); центрифуга лабораторная (5 тыс. об./мин) (ГОСТ 15150-69 «Машины, приборы и другие технические изделия»); чашки Петри (ГОСТ 19908-90 «Тигли, чаши, стаканы, колбы, воронки, пробирки и наконечники из прозрачного кварцевого стекла»); ножницы.
Растворы и реактивы: вода водопроводная (ГОСТ 2874-82 «Вода питьевая. Гигиенические требования и контроль за качеством»); кислота соляная концентрированная (уд. масса 1,2) (ГОСТ 3118-77 «Реактивы. Кислота соляная. Технические условия»); пепсин пищевой свиной (ТУ 9219-564-00419779-2000).
Ход работы: подготовка проб ткани; приготовление искусственного желудочного сока (ИЖС); переваривание и оценка результатов, концентрация личинок.
1. Пробу массой 50,0 г (паренхима легких или печени) тщательно измельчали в мясорубке с диаметром решетки 3-4 мм.
2. Для проведения исследования использовали ИЖС, приготовленный по следующей прописи: вода водопроводная - 1000 см3 (температура 41-42 °С); кислота соляная концентрированная (удельная масса 1,2) - 11 см3; пепсин пищевой свиной - 7,0 г.
3. ИЖС заливали в реактор, после прогрева в него помещали стакан с фаршем, и аппарат устанавливали в режим работы: переваривание - 60 мин при 41-42 °С, время отстаивания пробы 10 мин при автоматическом перемешивании пробы и поддержании выбранной температуры. После отстаивания из реактора осадок сливали в объеме 15-20 см3.
4. Осадок исследовали в чашке Петри под лупой для определения наличия личинок (при переваривании свежего материала личинки сохраняют свою подвижность). Для концентрации полученного материала осадок центрифугировали при 5000 об./мин 10 мин. После этого из пробирки удаляли 10,0 мл верхнего слоя жидкости, а осадок использовали для дальнейших исследований.
Литература
1. Glamazdin I.G., Petrushina S.V., Hisamov I.R. Toksokaroz sobak, diagnostika i metody jepizooticheskogo nadzora // Vet. vrach. – 2007. - № 3. – S. 28-31.
2. Zamazij T.N., Zdor O.A. Osobennosti jepidemiologii i klinicheskogo techenija toksokaroza v sovremennyh uslovijah // Mezhdunar. med. zhurnal. 2005. – № 1. – S. 133-135.
3. Solopov P.A. Immunofermentnyj metod diagnostiki toksokaroza sobak, serojepizootologicheskij monitoring i terapija: Dis. … kand. vet. nauk. - Rjazan', 2009. – 114 s.
4. Tumol'skaja N.I., Sergiev V.P., Lebedeva M.N. i dr. Toksokaroz. Klinika. Diagnostika. Lechenie. Profilaktika. – Novosibirsk, 2004. – 48 s.