English version
УДК: 571.27
DOI:
Поступила в редакцию: 11.06.2016
Принята в печать: 27.02.2017
Для цитирования:
Гришина Е. А. Исследование показателей апоптоза лимфоцитов крови животных при гельминтозах // Российский паразитологический журнал. – 2017. – Т.40.- Вып. 2 . – С.
For citation:
Grishina E.A. Study of markers of blood lymphocytes apoptosis in animals at helminthiases // Russian Journal of Parasitology, 2017, V.40, Iss.2, pp.
ИССЛЕДОВАНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ АПОПТОЗА ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ЖИВОТНЫХ ПРИ ГЕЛЬМИНТОЗАХ
Гришина Е. А.
ГБОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования Минздрава России
125993, г. Москва, ул. Баррикадная, д.2/1, стр.1, gelana2010@yandex.ru
Реферат
Изучение роли апоптоза клеток крови позволяет наиболее точно определить механизмы развития иммунопатологии в целом, и иммуносупрессии – в частности. Целью исследований было изучить морфологические и молекулярные показатели апоптоза лимфоцитов периферической крови при трихоцефалезе мышей и пассалурозе кроликов для определения возможных механизмов развития вторичной иммунодепрессии при хронизации гельминтозного процесса.
Материалы и методы. В ходе эксперимента животные были подразделены на следующие группы: 1) интактные мыши (контрольная группа) – 15 шт.; 2) интактные кролики (контрольная группа) – 10 шт.; 3) мыши, зараженные Trichocephalus muris (Schrank,1788) - 60 шт.; 4) кролики, зараженные Passalurus ambiguous (Rudolphi, 1819) – 30 шт.
Для приготовления мазков через 1, 2, 3 и 6, 7, 8 недель после заражения служила кровь из хвостовой вены мышей и из ушной вены кроликов. Определение лейкоцитарной формулы и исследование морфологических признаков апоптоза проводили методом световой микроскопии мазков крови, окрашенных по Романовскому [ 2 ].
Для молекулярных исследований мононуклеарные лейкоциты выделяли из цельной венозной крови путем центрифугирования на градиенте плотности Ficoll-Paque (=1,077 г/см3, «Pharmacia», Швеция) [12]. Концентрацию проапоптотического белка caspase-3 и антиапоптотического белка Bcl-2 определяли в лизате лимфоцитов методом иммуноферментного анализа с использованием наборов Human Caspase-3 instant ELISA и Human Bcl-2 ELISA фирмы «Bender MedSystems GmbH» (Вена, Австрия).
Результаты и обсуждение. Анализ полученных данных свидетельствует о том, что при заражении животных гельминтами и в процессе хронизации гельминтозных процессов на протяжении 8 недель происходят достоверно значимые изменения в общем числе лейкоцитов, общем количестве лимфоцитов и количестве лимфоцитов с морфологическими признаками апоптоза, а также в уровнях проапоптотического белка caspase-3 и антиапоптотического белка Bcl-2.
В результате проведенного комплексного исследования достоверно показано, что у животных от начала заражения до хронической стадии гельминтозного процесса наблюдается постепенное и значительное повышение апоптотической активности лимфоцитов на рецепторном и клеточном уровнях. Это проявляется в повышении содержания количества лимфоцитов с морфологическими признаками апоптоза на фоне увеличения уровня проапоптотического белка caspase-3 и снижения уровня антиапоптотического белка Bcl-2.
Ключевые слова: гельминтозы, иммунитет, иммунодепрессия, апоптоз лимфоцитов, индукторы и ингибиторы апоптоза.
Введение
Изучение особенностей апоптоза клеток крови при развитии вторичной иммунодепрессии при гельминтозах в доступной литературе крайне немногочисленны и фрагментарны [3]. Уже установлено, что метаболиты некоторых гельминтов обусловливают апоптотическую активность как в соматических, так и в генеративных клетках хозяина [1, 5, 15]. Выявленные факты индукции апоптоза в иммуно- компетентных клетках совсем малочисленны, но еще более интересны, т.к. позволяют наиболее точно определить механизмы развития иммуносупрессии при хронизации гельминтозного процесса.
S.K. Lundy et al. [15] и др. [8, 10, 17] показали, что апоптоз CD4+ Т-лимфоцитов селезенки максимально возрастает в острую стадию шистосомоза (8 нед после заражения) и снижается в хроническую стадию заболевания (16 нед после заражения).
При совместной культивации Т- лимфоцитов человека с живыми половозрелыми Necator americanus, а также с белковыми секреторно-экскреторными продуктами (СЭП) этого паразита, S.C. Chow et al. [6] установили, что происходит повышение уровня фрагментации ДНК этих клеток и рост числа апоптотических клеток среди них. Изменения находились в линейной зависимости от числа паразитов, концентрации белковых продуктов гельминтов и возрастали при их увеличении [6].
В 2004 г. P. Tato et al. [18] установили, что метацестоды и цисты свиных цепней секретируют цистеин-протеазу, которая in vitro вызывает в CD4+ T-лимфоцитах человека типичные для апоптоза нарушения (целостность клеточной мембраны, перетяжки и фрагментация ядра, хроматиновая конденсация, появление апоптотических тел и исчезновение микротрубочек).
Как известно, основными фигурантами эффекторной стадии апоптоза являются цистеиновые протеазы (каспазы). Каспазы расщепляют белки, являющиеся мишенями для их действия, весьма характерным для апоптоза образом – в местах расположения аспарагиновых оснований. К таким эффекторным каспазам – исполнителям апоптоза, относится каспаза- 3. Одна из основных функций эффекторных каспаз заключается в прямом и опосредованном разрушении клеточных структур. Гидролизу подвергаются белки ядерной мембраны, разрушается цитоскелет, расщепляются белки, регулирующие клеточную адгезию.
В настоящее время каспазу-3 рассматривают как фермент, принадлежащий к группе апоптотических каспаз, передающих и реализующих сигнал клеточной гибели. Однако сейчас становится ясным, что некоторые протеиназы - не просто ферменты деградации, но и строго регулируемые сигнальные молекулы, контролирующие критические биологические процессы путем специфического ограниченного протеолиза. Мнение о том, что каспазы - не только убийцы [14], находит подтверждение в результатах, полученных в последние годы и свидетельствующих о том, что каспазы участвуют в различных неапоптотических клеточных физиологических процессах.
Так стало известно, что каспаза-3 принимает участие в регуляции клеточного цикла [19, 7] процессинге цитокинов [20], дифференцировке миоцитов [11] пролиферации T- лимфоцитов [4, 13]. Иными словами, каспаза-3 имеет плейотропные функции [9, 16], далеко не ограничивающиеся участием в реализации внутриклеточной апоптотической программы.
Другой важной функцией эффекторных каспаз является инактивация белков, блокирующих апоптоз. К такой группе ингибиторов апоптоза принадлежат антиапоптозные белки семейства Bcl-2. Регуляция апоптоза белками семейства Bcl-2 осуществляется преимущественно на отрезке митохондриального сигнального пути, так как сигналы от рецепторов смерти в основном обходят контроль со стороны Bcl-2.
Предполагается, что для регуляции ответа клетки на сигналы смерти, имеет значение соотношение про- и антиапоптозных белков.
Целью исследования было изучить цитологические и молекулярные показатели апоптоза лимфоцитов периферической крови при трихоцефалезе мышей и пассалурозе кроликов для определения возможных механизмов развития вторичной иммунодепрессии.
Материалы и методы
В эксперименте использовались 75 белых мышей со средним весом тела 18-20 г и 40 кроликов со средним весом 2,5 кг. Мыши и кролики содержались в стандартных условиях вивария Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина. Животные были подразделены на следующие экспериментальные группы:
1. Интактные мыши (контрольная группа) – 15 шт.
2. Интактные кролики (контрольная группа) – 10 шт.
3. Мыши, зараженные Trichocephalus muris (Schrank,1788) - 60 шт.
4. Кролики, зараженные Passalurus ambiguous (Rudolphi, 1819) – 30 шт.
В течение эксперимента мышей декапитировали через 1, 2, 3 и 6, 7, 8 недель после заражения под рауш- наркозом. Для приготовления мазков служила кровь из хвостовой вены мышей. У кроликов брали кровь из ушной вены без декапитации. Определение лейкоцитарной формулы и исследование морфологических признаков апоптоза проводили методом световой микроскопии мазков крови, окрашенных по Романовскому [ 2 ].
Лейкоцитарную формулу определяли на основании дифференциального подсчета 200 лейкоцитов в окрашенном мазке крови и последующего вычисления их процентного содержания.
Для морфологического исследования апоптоза готовили мазки крови сразу после получения и в полученных мазках подсчитывали количество лимфоцитов с признаками апоптоза разной степени в процентах от доли лимфоцитов в общей лейкоцитарной формуле. Морфологические изменения лимфоцитов, характерные для апоптоза (уменьшение размеров клеток и их вакуолизация, уменьшение ядер с конденсацией и грануляцией хроматина), оценивали с помощью микроскопа МИКМЕД –2.
Для молекулярных исследований мононуклеарные лейкоциты выделяли из цельной венозной крови путем центрифугирования на градиенте плотности Ficoll-Paque (=1,077 г/см3, «Pharmacia», Швеция) [12]. Концентрацию проапоптотического белка caspase-3 и антиапоптотического белка Bcl-2 определяли в лизате лимфоцитов методом иммуноферментного анализа с использованием наборов Human Caspase-3 instant ELISA и Human Bcl-2 ELISA фирмы «Bender MedSystems GmbH» (Вена, Австрия). Исследование проводили в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Результаты ИФА оценивали на автоматическом микропланшетном спектрофотометре «Epoch BioTek Instruments» (США) при длине волны 450 нм.
Полученные данные были статистически обработаны с использованием критерия Стьюдента и с помощью программ STATISTICA (версия 8.0) для Windows и SPSS (версия 11.0).
Результаты и обсуждение
В ходе эксперимента нами было установлено изменение цитологических и молекулярных показателей периферической крови в процессе хронизации трихоцефалеза мышей и пассалуроза кроликов. Анализ полученных данных свидетельствует о том, что при заражении животных геогельминтами и в процессе развития гельминтозных процессов на протяжении 8 недель происходят характерные изменения в общем числе лейкоцитов, общем количестве лимфоцитов и количестве лимфоцитов с морфологическими признаками апоптоза, а также в уровнях проапоптотического белка caspase-3 и антиапоптотического белка Bcl-2. (Табл.1, 2).
Таблица 1
Изменение цитологических и молекулярных показателей апоптоза в периферической крови мышей в процессе развития трихоцефалеза
|
Клеточные и и молекулярные показатели крови мышей |
Контр. группа мышей n=15 |
Экспериментальная группа мышей, зараженных трихоцефалезом в разные сроки (нед) развития инвазии, n=60 |
|||||
|
1 нед n=10 |
2 нед n=10 |
3 нед n=10 |
6 нед n=10 |
7 нед n=10 |
8 нед n=10 |
||
|
Общее число лейкоцитов (*109/л) ±m |
9,51± 0,338 |
11,35± 0,324 |
12,87± 0,136 |
13,81± 0,136 |
11,65± 0,309 |
9,56± 0,193 |
7,43± 0,116 |
|
Количество лимфоцитов (*109/л) ±m |
6,50± 0,318 |
6,80± 0,338 |
8,75± 0,544 |
7,26± 0,421 |
5,13± 0,238 |
5,03± 0,108 |
4,78± 0,158 |
|
68 % |
59,9% |
67,9% |
|
|
|
|
|
|
Количество лимфоцитов с признаками апоптоза (*109/л) ±m |
1,05± 0,038 |
2,28± 0,038 |
3,41± 0,068 |
7,32± 0,064 |
9,12± 0,064 |
10,08± 0,042 |
10,30± 0,076 |
|
16,2% |
33,5% |
38,9% |
|
|
|
|
|
|
Уровень caspase-3 (мкг/мл) |
2,41± 0,021 |
3,53± 0,019 |
4,48± 0,017 |
5,61± 0,013 |
7,39± 0,030 |
8,40± 0,034 |
9,61± 0,042 |
|
Уровень Bcl-2 (нг/мл) |
8,63± 0,030 |
7,40± 0,024 |
6,21± 0,021 |
5,84± 0,018 |
3,49± 0,014 |
3,01± 0,009 |
2,46± 0,006 |
Таблица 2
Изменение цитологических и молекулярных показателей апоптоза в периферической крови кроликов в процессе развития пассалуроза
|
Клеточные и и молекулярные показатели крови кроликов |
Контр. группа кроликов n=10 |
Экспериментальная группа кроликов, зараженных пассалурозом в разные сроки (нед) развития инвазии, n=30 |
|||||
|
1 нед n=5 |
2 нед n=5 |
3 нед n=5 |
6 нед n=5 |
7 нед n=5 |
8 нед n=5 |
||
|
Общее число лейкоцитов (*109/л) ±m |
7,61± 0,318 |
9,25± 0,318 |
10,67± 0,132 |
12,41± 0,141 |
11,35± 0,320 |
10,26± 0,188 |
6,53± 0,146 |
|
Количество лимфоцитов (*109/л) ±m |
4,50± 0,158 |
6,80± 0,316 |
5,75± 0,364 |
4,26± 0,371 |
3,13± 0,298 |
2,03± 0,138 |
1,78± 0,218 |
|
59 % |
74 % |
54 % |
34 % |
28 % |
|
|
|
|
Количество лимфоцитов с признаками апоптоза (*109/л) ±m |
0,31± 0,013 |
0,28± 0,015 |
0,61± 0,023 |
0,82± 0,034 |
1,08± 0,041 |
1,38± 0,037 |
1,50± 0,048 |
|
7 % |
4 % |
11 % |
19 % |
35 % |
68 % |
84 % |
|
|
Уровень caspase-3 ( мкг/мл) |
3,87± 0,030 |
4,41± 0,027 |
4,97± 0,019 |
5,27± 0,034 |
6,83± 0,026 |
7,69± 0,039 |
9,53± 0,041 |
|
Уровень Bcl-2 (нг/мл) |
10,01± 0,041 |
9,31± 0,036 |
8,47± 0,025 |
7,34± 0,018 |
5,98± 0,013 |
4,64± 0,011 |
3,28± 0,009 |
В мазках периферической крови мышей, зараженных трихоцефалезом, а также в мазках периферической крови кроликов, зараженных пассалурозом, уже на первых неделях после заражения, было зафиксировано увеличение общего числа лейкоцитов по сравнению с контрольными группами ( контроль: 9,51± 0,338 , трихоцефалез: 11,35± 0,324; контроль: 7,61± 0,318, пассалуроз: 9,25± 0,318 (*109/л) ±m ) и резкое снижение числа лейкоцитов к 6-ой-8-ой неделе после заражения, что явно свидетельствует о развитии иммунодепрессии: ( трихоцефалез: до 7,43± 0,116; пассалуроз: до 6,53± 0,146 (*109/л) ±m ) . При этом происходит уменьшение общего количества лимфоцитов (контроль: 6,50± 0,318, трихоцефалез: до 4,78± 0,158; контроль: 4,50± 0,158, пассалуроз: до 1,78± 0,218 (*109/л) ±m )); и повышение количества лимфоцитов с морфологическими признаками апоптоза (контроль: 1,05± 0,038, трихоцефалез: 10,30± 0,076; контроль: 0,31± 0,013 , пассалуроз: 1,50± 0,048 (*109/л) ±m )). У таких клеток наблюдалась деградация ядерного материала, происходила грануляция хроматина и его фрагментация на несколько частей.
Количество caspase-3 антиапоптотического белка в контрольной группе мышей составило 2,41± 0,021мкг/мл. Развитие трихоцефалеза на первых этапах ( 1-3 нед) уже приводило к значимым изменениям исследуемого параметра от 3,53± 0,019 до 5,61± 0,013 мкг/мл, однако в условиях хронизации гельминтозного процесса наблюдалось более значительное увеличение уровня проапоптотического белка – от 7,39± 0,030 до 9,61± 0,042 мкг/мл (p<0,05) (табл. 1).
Количество caspase-3 антиапоптотического белка в контрольной группе кроликов составило 3,87± 0,030 мкг/мл. Развитие пассалуроза на первых этапах ( 1-3 нед) также приводило к значимым изменениям исследуемого параметра от 4,41± 0,027 до 5,27± 0,034 мкг/мл, а в условиях хронизации гельминтозного процесса наблюдалось еще более значительное увеличение уровня проапоптотического белка – от 6,83± 0,026 до 9,53± 0,041 мкг/мл (p<0,05) (табл. 2).
Полученные результаты могут свидетельствовать о том, что в организме в условиях хронического трихоцефалеза и пассалуроза на иммунокомпетентные клетки может оказывать токсическое действие не столько сами гельминты, а их активные метаболиты, в частности активные формы кислорода, являющиеся следствием оксидативного стресса.
Уровень Bcl-2 в лимфоцитах периферической крови контрольной группы мышей составил 8,63± 0,030 нг/мл. Развитие гельминтозного процесса - трихоцефалеза и его хронизация приводили к достоверному снижению количества антиапоптотического белка – от 7,40± 0,024 до 2,46± 0,006 нг/мл (табл. 1).
Уровень Bcl-2 в лимфоцитах периферической крови контрольной группы кроликов составил 10,01± 0,041 нг/мл. Развитие пассалуроза и его хронизация приводили к достоверному снижению количества антиапоптотического белка – от 9,31± 0,036 до 3,28± 0,009 нг/мл (табл. 2).
Заключение
Таким образом, длительное развитие инвазионного процесса вызывает активацию проапоптотического белка caspase-3 и снижение экспрессии Bcl-2 в лимфоцитах животных. Выявленные нами данные свидетельствуют о том, что в условиях возможного окислительного стресса наблюдается индукция апоптоза лимфоцитов, что выражается в значительном увеличении уровня caspase-3, повышении доли клеток с морфологическими признаками апоптоза и снижении уровня антиапоптотического белка Bcl-2.
В результате проведенного комплексного исследования достоверно показано, что у животных, находящихся в хронической стадии гельминтозного процесса, наблюдается повышенная апоптотическая активность лимфоцитов на рецепторном и клеточном уровнях, проявляющаяся в повышении содержания лимфоцитов с морфологическими признаками апоптоза на фоне увеличения уровня проапоптотического белка caspase-3 и снижения уровня антиапоптотического белка Bcl-2.
Литература
1. Бекиш В.Я., Дурнев А.Д. Генотоксическое и цито-токсическое воздействия белковых соматических продуктов гельминтов на лимфоциты крови доноров in vitro // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2004. - Т. 138, № 8. - С. 198-201.
2. Рябыкина Н. В. Исследование апоптоза клеток белой крови и изменение лейкоцитарной формулы у старых самцов мышей при действии гипогидратационного стресса и α– токоферолацетата // Молодой ученый. — 2010. — №12. Т.1. — С. 57-59.
3. Фильченков, А.А. Апоптоз и рак / А.А. Фильченков, Р.С. Стойка // Киев: Морион. 1999. - 184 с.
4. Ярилин А.А. Иммунология: учебник. 2010. - 752 с.: ил.
5. Alam M. S., Chowdhury M. A. Z., Khaliq Q. A., Yasmin S. Stability analysis for seed yield and its components in soybean (Glycýne max (L.) Merrill). Annals of Bangladesh Agriculture, 1999, no. 9, pp. 43-48.
6. Bekish V.J. The alterations in genetic apparatus of somatic and generative cells of the host caused by helminthes metabolites. Wiadomosci Parazytologiczne (Poland), 2001, vol. 47, no. 4, pp. 891-896.
7. Chow S.C., Brown A., Pritchard D. The human hookworm pathogen Necator americanus induces apoptosis in T lymphocytes. Parasite Immunology, 2000, vol. 22, pp. 29-37.
8. Eymin В., Claverie P. Salon C. PI4arf Triggers G2 Arrest through. Oncogene, 1999, vol. 18, pp. 1411-1418.
9. Estaquier J., Marguerite M., Sahuc F. Interleukin 10-mediated T cell apoptosis during the T helper type 2 cytokine response in murine Schistosoma mansoni parasite infection. Eur. Cytokine Netw., 1997, vol. 8, pp. 153-160.
10. Fadeel, B., Orrenius S., Zhivotovsky B. Apoptosis in human disease: a new skin for the old ceremony?” Biochem Biophys Res Commun., 1999, vol. 266, no.3, pp. 699-717.
11. Fallon P.G., Smith P., Dunne D.W. Type 1 type 2 cytokine producing mouse CD4+ and CD8+ cells in acute Schistosoma mansoni infection. Eur. J. Immunol., 1998, vol. 28, pp. 1408-1416.
12. Fernando H.C., Luketich J.D., Christie N.A., Ikramuddin S., Schauer P.R. Outcomes of laparoscopic Toupet compared to laparoscopic Nissen fundoplication. Surg. Endose., 2002, vol.1, pp. 905-908.
13. Gondal, M.A., Laser photoacoustic spectrometer for remote monitoring of atmospheric pollutants, Applied Optics, 1997, vol. 36, no. 15ISSN: 1559-128X (print) ISSN: 2155-3165 (online)
14. Kennedy P. M., Lowry, J. B., Conlan, L. L., Isolation of grass cell walls as neutral detergent fibre increases their fermentability for rumen micro-organisms. J. Sci. Food Agric., 1999, vol. 79, no. 4, pp. 544-548.
15. Los M., Stroh C., Jänicke R.U. Caspases: more than just killers? Trends Immunol., 2001, vol. 22, no. 1, pp. 31-34.
16. Lundy S.K., Lerman S.P., Boros D.L. Soluble egg antigen-stimulated T helper lymphocyte apoptosis and evidence for cell death mediated by FasL+ T and B cells during murine Schistosoma mansoni infection. Infection and Immunity, 2001, vol. 69, no. 1, pp. 271-280.
17. Robertson J.D., Orrenius S., Zhivotovsky B.J. Struct. Biol., 2000, no.129, pp. 346–358.
18. Rumbley C.A., Zekavat S.A., Sugaya H. The schistosome granulema: characterization of lymphocyte migration, activation and cytokine production. J. Immunol. 1998, vol. 161, pp. 4129- 4137.
19. Tato P., Fernandez A.M., Solano S. A cysteine protease from Taenia solium metacestodes induce apoptosis in human CD4+ T-cells. Parasitol. Res., 2004, vol. 92, no. 3, pp. 197-204.
20. Zhou D., Lambert, S., Malen P.L., Carpenter S., Boland L.M., Bennett V. J. Cell Biol., 1998, no. 143, pp.1295-1304.
21. Zhang J, Rosenberg HF, Nei M. Positive Darwinian selection after gene duplication in primate ribonuclease genes. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA), 1998, no. 95, pp. 3708-3713.
© 2017 The Author(s). Published by All-Russian Scientific Research Institute of Fundamental and Applied Parasitology of Animals and Plants named after K.I. Skryabin. This is an open access article under the Agreement of 02.07.2014 (Russian Science Citation Index (RSCI) http://elibrary.ru/projects/citation/cit_index.asp) and the Agreement of 12.06.2014 (CA-BI.org/Human Sciences section: http://www.cabi.org/Uploads/CABI/publishing/fulltext-products/cabi-fulltext-material-from-journals-b...)